主要方法
免疫熒光技術(shù):利用抗原與的特異性結(jié)合原理,將熒光標記的與細胞內(nèi)的目標蛋白結(jié)合,湖北亞細胞定位,然后通過熒光顯微鏡觀察熒光信號的位置,從而確定目標蛋白的亞細胞定位。
綠色熒光蛋白(GFP)融合蛋白技術(shù):將綠色熒光蛋白基因與目標蛋白基因融合,構(gòu)建成融合蛋白表達載體。當該載體在細胞中表達時,產(chǎn)生的融合蛋白會帶有綠色熒光,洋蔥亞細胞定位,可直接通過熒光顯微鏡觀察其在細胞內(nèi)的分布,進而確定目標蛋白的亞細胞定位。
基因法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞:
分別用70%乙醇和滅菌蒸餾水清洗金粉(直徑為1 μm),加入滅菌蒸餾水制成金粉懸浮液,取100 μL 放在含有1.0 cm2 洋蔥表皮的玻璃皿中,邊振蕩邊加入10 μL pCambia2301-GaMYB2-GFP質(zhì)粒,逐步加入40 μL 0.1 mol·L-1 亞精胺和100 μL2.5 mol·L-1 CaCl2,振蕩混勻。基因GDS-80轟擊時氦氣罐的氣壓為1 300 psi,取10 μL DNA 包裹好的微粒懸浮液加到基因中央,進行轟擊,之后放置25℃避光過夜培養(yǎng),使用ConfocalLaser激光共聚焦顯微鏡觀察。
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