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武漢科銳諾生物科技有限公司

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植物組織原位雜交檢測技術服務-科銳諾(圖)

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分子病理學在蛋白質和核酸等生物大分子水平上,應用分子生物學理論、技術及方法研究疾病發(fā)生L發(fā)展的過程,從而為傳統(tǒng)的病理學注入了生機。在如今的臨床病理診斷過程中,運用核酸原位雜交、PCR技術、免1疫熒光、免1疫組織化學染色等技術,能夠更加深化對疾病的本質認識,對于腫1瘤的診斷和治1療也有著臨床的指導意義。分子病理學診斷主要應用于以下幾個方面:1、對于腫1瘤易感基因的檢測,對于腫1瘤高危人群的篩檢具有實用價值,如檢測GSTπ基因以判定個體暴露于致癌物是的致癌危險性。2、腫1瘤相關病毒的檢測,如采用原位雜交方法檢測標本中HPV、EBER等病毒。

.雜交 (1) 盛有2×SSC的塑料盤同,將干烤的濾膜飄浮在液面上,浸濕5分鐘。(2) 將濾膜轉到200ml預洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起,放于溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿,放到位于培養(yǎng)箱內的旋轉平臺上。于50℃處理30分鐘。在這一步及以后的所有步驟中,應緩緩搖動濾膜,防止它們粘在一起。(3) 用泡過預洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細菌碎片,以降低雜交背景而不影響陽性雜交信號的強度和清晰度。(4) 將濾膜轉到盛有150ml預雜交液的玻璃中,在適宜溫度(即在水溶液中雜交時用68℃,而在50%甲酰胺中雜交時用42℃)下,預雜交1-2小時。(5) 將32 P標記的雙鏈DNA探針于100℃加熱5分鐘,迅速置于冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間,盛濾膜的容器應蓋嚴,以防液體蒸發(fā)。

原位雜交天

1. 重新水化和固定

1) 吸取固定好的胚胎,加入50%的PBST溶液,放置5分鐘。

2) 置換成30%的PBST溶液,放置5分鐘

3) 置換成PBST溶液,放置5分鐘,植物組織原位雜交檢測技術服務,重復一次

4) 置換成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘5) 用PBST洗兩次,每次放置五分鐘,室溫。

蛋白酶處理與后固定(本實驗不做此步)

1) 用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節(jié)以下的胚胎不處理,5體節(jié)到24小時的胚胎處理3分鐘,24小時以上的胚胎處理5分鐘或者更長。發(fā)育時間越短的胚胎越嫩,可以不用或者少用蛋白酶處理,發(fā)育時間長的胚胎就需要用蛋白酶來疏松組織,以便于雜交。

2) 用PBST溶液輕洗,在PBST中放置5分鐘。

3) 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘,室溫。

4) 用PBST洗兩次,每次放置五分鐘,室溫。

2. 預雜交

1)每個管中置換成大約300ulHYB-溶液,60℃水浴5分鐘,避免振蕩。

2)用等體積的HYB+取代HYB-。

3)60℃水浴,預雜交4小時以上。

3. 雜交

1)吸去預雜交的HYB+,加上100ul已加入探針的HYB+溶液(探針濃度約為1ng/ul)..

2)60℃ 溫浴過夜。注:雜交與預雜交的溫度可以是55到60度不等,溫度越低,探針結合越好,溫度越高,背景越小。

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